金沙4166官网登录,核心提示:前一阵子一直在做双酶切质粒重组,失败了 很多次,不过很快改善了
实验方法,用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会,谈一下质粒

核心提示:前一阵子一直在做双酶切质粒重组,失败了 很多次,不过很快改善了
实验方法,用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会,结合丁香园

核心提示:TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些?参考见解:
TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。NEB公司的酶的

前一阵子一直在做双酶切质粒重组,失败了 很多次,不过很快改善了
实验方法,用2周重组了
14个质粒。现就自己的体会,谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收PCR产物:在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的
选择非常重要,尽量选择粘端酶切和
那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的

前一阵子一直在做双酶切质粒重组,失败了 很多次,不过很快改善了
实验方法,用2周重组了
14个质粒。现就自己的体会,结合丁香园战友的宝贵经验,谈一下质粒重组的一些个人经验。

TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些?参考见解:
TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。NEB公司的酶的活性很高,切出两条小带可能是因为出现星活性,可以试试把酶量减半。NEB的酶很多都是克隆的,所以纯度比较高。应用磁性微球提取人全血基因组DNA,将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应,应用Taq1酶,但发现酶切后产生的是smier片断,即切碎的状态。不知原因是什么?在做这类实验时,一般是将PCR产物进行酶切,这与实验结果有联系吗?是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增,才能应用酶切?参考见解:1.
为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2.
电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3.
一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度,又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。请教该怎么办?参考见解:回收酶切产物浓度低的原因可能是:苯酚/氯仿抽提时损失太多。说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次,这样经过四次抽提DNA损失得非常多,解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水,然后再抽提,损失会减少很多;另外乙醇沉淀时可以延长,低温沉淀会提高得率;还有用80%乙醇洗涤沉淀弃上清时,要轻轻用移液枪吸出,防止将沉淀随上清倒出。注意这几点应该可以回收到理想浓度的DNA了。做PCR将分别将50和300bp片段扩出后,将两个片段连接到一起为550bp,要将550bp片段连到载体上,但550bp片段中间产生了新的酶切位点跟设计的酶切位点AseI一样,想通过部分酶切方法得到550的片段,如果完全酶切就分成原来的两个片段,求教部分酶切的详细方法?参考见解:可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接,之后再进行平化连接,这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。部分酶切关键是酶切时间,可以先摸索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中,37度酶切,然后每隔一段时间取出一部分(比如5微升或10微升),然后一起进行核酸电泳,摸索一下合适的酶切时间。部分酶切的话,时间应该不能太长,可以每间隔5分钟或10分钟左右就取一次。要将PCR片段连入表达载体中,选的是TaKaRa的BamH
I和Hind
III,请问这个双酶切是在37度反应还是30度,要酶切多长时间?PCR片段比较难切吗,引物两端都各加了3个保护碱基?参考见解:一般37度2小时就行,在酶切时,由于你所选用的酶都是效率比较高的,酶切一个小时就已经足够了。不过若不放心,过夜也没问题。buffer需要共用buffer。PCR片段的酶切效率与引物两端所加保护碱基有很大关系。如果保护碱基加的恰当,酶切应该不成问题。PCR产物,由于浓度较低,并不难切,只是在连接转化时难以成功。BamH
I一般加CGGGATCCCG的酶切效率高达90%。其它酶的具体情况可以查NEW ENGLAND
BioLabs的目录。按new england
biolab的介绍,hindIII切割的时间较长,如果,直接切pcr产物再连接有时效率不高,导致转化效率低。如果有条件的话,可以先做at克隆,再酶切。TaKaRa的产品目录的A部分里有关于双酶切所用buffer的详细说明,最好依照执行。PCR反应后,是否可以直接用来酶切,而不需要从凝胶上回收后再酶切!酶切后直接在4%琼脂糖凝胶上电泳分型,有四种片段91,83,72,48BP,想用凝胶电泳对其六种表现型分型,不知可行否?参考见解:理论上是可行的但是主要取决于PCR产物与酶切产物的大小差距,差距太小不容易获得很纯的片断,为什么不在酶切后连在载体质粒上呢,再筛选阳性克隆,是否作表达?至于看六种表型建议用PAGE胶电泳做SSCP,用银染分辨率高,可能能解决问题。PCR产物经过酶切连接到载体上,所用酶切位点是(BamHI,EcoRI)均有8个保护碱基。但是无论怎么切,总是连接不上?什么原因?参考见解:1、
PCR产物是否经过纯化了?PCR产物中有较高的离子强度,会影响酶切,如果不经过纯化,则酶切体系中的PCR产物应该适当减少。2、
vector是T-vector还是其他的,如果是其他的话,那要考虑vector在酶切时,是否是切完全了的,将PCR产物测序,看是否有要的酶切site.3、
虽说有这么多的保护碱基,假设它们对酶切足够的,但也要遵循其它的条件,如这两个酶在做双酶切时,是否用了它们能通用的缓冲液?也就是说这两种在这种缓冲液中必须要有足够的酶切效率。有两种方法可以上试:
分两次酶切。即先用一种酶切,胶回收后再用另一种酶切。这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到了最大的酶切效率。
克隆到T载体中。不知道加的是什么保护碱基,是不是有足够的保护作用?克隆到T载体中,则不要考虑受这个条件的限制。4、
按照NEB公司推荐的保护碱基经验,BamH1和EcoRI前加CG就够了,用不着加那么多。当然,加那么多不大会是试验失败的原因。5、
BamH1和EcoRI都是甘油浓度敏感型的,就是说酶量加的太多了会引起Star活性。不知你的酶切体系如何设定的。6、
先检查设计引物设计中酶切位点是否正确,然后再重复一次。当然先连到T载体是万无一失,但是克隆周期也延长了。加了保护碱基,却切不动?参考见解:1、
酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液,它们的差别只是离子浓度与体系的不同,如Na、k、Mg等,还有PH值及缓冲体系(一般Tris-HCl),另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液,要达到高酶切效率,选择是个问题,如果酶切时间和量足够,解决的方法:1)
使用其中一个酶的缓冲液,但要考虑到另一酶的反应效率,反应效率如何,可以查查酶在不同buffer里的效率参数,具体见公司网站,如NEB提供了很好的buffer参数:2)
使用它们的通用的缓冲液,使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率;没有通用的BUFFER怎么办呢?
分两次酶切。即先用一种酶切,胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐,这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率,但缺点是要回收,损失大
;3)
克隆到T载体中,值得推荐的方法,克隆到T载体中,不须要考虑受这个条件的限制,酶切位点也可以用T载体上自带的。2、
酶切温度。酶切温度也很重要,一般的酶切最适温度为37度,有些特殊的酶的反应温度不同,如Sma
Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切,先低温后高温。3、
酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全,一般为1-3h,这个时间已经足够,对于一些活性较好的酶,30min就可以酶切完全,建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率;PCR产物的酶切时间较长,一般过夜。4、
酶失活。如果使用酶解冻后放置太久,可能导致酶失活。这种情况较少见,只能换新酶。如果拿了不同公司的酶,buffer也不一样,怎么办?放心,可以用不同公司的酶进行双酶切,一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比,选择它们都有适中活性的buffer,每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的!5、
酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度,在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图,尤其插入的是小片段DNA,酶切后产物量较少,可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量,建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓,做到心中有数。要将目的片段插进载体,选择的酶切位点是Xho1和EcoR1,但是这两个位点共用一个碱基G,即CTCGAGAATTC。还有一对位点是Xba1和Sal1,中间没有空,即TCTAGAGTCGAG。请问这两种情况能不能切开,或是只能通过单酶切来实现?参考见解:1、
还是有可能切开的,双酶切不行就分开切试试。再不行,又实在想用这个载体的话,可以变通一下。设计一个短片段DNA,两头带EcoR
I的粘性末端,与EcoR
I酶切后的载体连接,获得新的载体,以后再做就不会遇到这个问题了。2、
可以先接上一个片段,再做两次单酶切。例如:载体用BamH
I切开,连上两端都是BamH I末端的一个片段——->用EcoR
I酶切,回收后再用BamH I切。3、 先用BamH I和EcoR
I同时双酶切试试。不行的话,就先用BamH I酶切再用EcoR
I酶切。怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切?参考见解:酶切后作个质粒自连实验,在感受态、连接酶等没问题的情况下,如果没有菌落长出,说明双酶切是成功的。当然,如果只长了很少的菌落,也是可以的。如果长了很多的菌落,那说明酶切不完全,这时候就只有一个酶切位点切开了,质粒发生了自连。目的片段连pET32a
,16度过夜,酶连体系为目的片段5μl,载体3μl,T4连接酶1μl,10*Buffer1μl.转化后涂LB-AMP平板,过夜平板长有菌落,但菌落不大,都很孤立,挑取菌落于LB-AMP液体摇菌过夜,试剂盒提取质粒后电泳一片弥散,无目的条带,这是哪个步骤出问题了?参考见解:1、
觉得是连接体系可能有问题,目的基因并没有跟载体连上,之所以长菌是由于AMP抗性的筛选压力不够,长了杂菌。2、
连接体系可能还需要再考虑,首先是目的片断与载体应该是摩尔数之比为3:1~6:1;其次转化是否也存在问题?即使是空质粒也是有条带的。还有可以在转化质粒时,以空质粒为对照这样来比较。电泳了纯化后的目的片段和载体都有,但载体没目的片段亮,酶连时是不是需要测核酸浓度后再算体积比?参考见解:必须计算浓度来估计:质粒加DNA浓度计算:质粒
PCR产物电泳后浓度B相对分子量 CD摩尔浓度
A/CB/D体积比xyx.a/c/=1/3=>x/y=bc/3adx/y=16/1,x+y=12x=16ul,y=1ulhPer11μl1μlPGBKT7
16μl16μlT4 ligase????1μl 混匀10*t4 ligase2ul水12ul

BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要,我一般酶切3个小时,其实1个小时已经足够。应用大体系,如100微升。

1、回收PCR产物:在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的
选择非常重要,尽量选择粘端酶切和
那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基,其原则可参照:

载体用NotI单酶切,目的片段也用NotI单酶切,并对载体进行去磷酸化,但一直也没连上?参考见解:1、
用NEB的高效连接酶连看看,用400U或2000U的试试2、 16度过夜连接,或更长3、
单酶切用PCR来鉴定方向方便些4、
去磷酸化后,将去磷酸化酶失活很重要,否则可能根本连不上。5、
失活的方法很多了,可以加热,可以直接过胶回收柱子,但比较放心的方法就是跑胶回收。PCR扩增到特异性产物后,回收PCR产物,PCR产物用BamHI和EcoRI在随EcoRI的BUFFER中双酶切8小时,同时,p
UC18 同样酶切,连接片段和载体DNA酶切均用QIAGEN quick spin
column回收片段,按NEB
连接酶说明过夜连接,连接产物电转化。但是,看转化结果,连接产物转化的平板大部分是蓝斑?什么原因?参考见解:1、
柱子回收一般没有问题,但会不会存在操作问题,所以回收产物可以跑胶或用紫外分光系统检测一下有没有DNA。2、
PCR产物直接酶切,在设计引物的时候有没有在酶切位点两边加保护碱基?这里pcr产物酶切出问题的可能性很大。3、
酶有没有问题?可以用这两个酶切一些已知的质粒看看能不能得到所要的片断。4、
大部分是蓝斑说明可能是载体酶切不完全,也可能是没有在载体酶切后跑胶回收载体,这样不能完全除去酶切掉的小片断(Qiagen的柱子对小片断的回收比较好),后来连接反应中小片断可能又连上了。5、
大部分是蓝斑,那就是还有白色的。挑了白色的摇了提质粒看看啊,说不定就有阳性的。6、
建议在载体酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化,这样可以彻底防止载体的自身环化。酶切目的基因及质粒载体后加Loading
buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭活限制酶,多高温度适合啊?参考见解:1、
一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段,干燥后直接用水溶解连接即可。比较适用于载体和PCR产物的连接。效果很好。2、
酶切后要胶回收后再连接,另外酶切结束后,直接电泳回收不用加终止液,对连接没有影响.3、
有的公司的限制酶是不需要热灭活的,而有的公司的限制酶则需要热灭活,一帮是65摄氏度,10分钟。然后经凝胶回收后再作连接,目的片段与质粒的摩尔比在3~10:1的范围内连接效果都不错。4、
通常随酶附送的loading
buffer是含有SDS起到灭活的作用,但在上样时会产生很多泡沫。一个质粒的双酶切,两种酶buffer一样,同时切胶。跑胶时,一个小片段看不到,大概600bp,怎么办?根据Marker把需要的4900bp的片段进行胶回收,效果特别差。用乙醇沉淀法回收,然后跑胶,回收,效果也不好。现在要做连接,可双酶切后质粒的回收不好,用于连接的质粒双酶切后怎么处理?把乙醇沉淀回收的双酶切质粒直接用于连接,这样可以吗?参考见解:1、
做双酶切的时候用的buffer都是根据公司提供的双酶切最适buffer,每个公司应该都提供双酶切使用的buffer列表。2、
酶切后电泳条带比较好,切胶回收的效果不好,可能是回收过程中操作出现问题,或者是回收试剂盒有问题。可以尝试更换试剂盒做回收试试,或者看看酶切电泳后目的条带有没有弥散,如果有,切胶回收得不到好的效果。3、
用于连接的的片段应是单一的,如果将双酶切的质粒直接用于连接,即使得到了转化子,鉴定也比较麻烦,自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。最好用回收产物做连接。4、
酶切时如果质粒很大>7kb那么希望得到的600bp亮度相对vector太暗了,可能看不到,如果600的带看不到,可以试试加大酶切的质粒的量。相同mol数600
和 4900的带亮度差别会很大。5、
如果酶没有问题那就要确定双酶切是否已经切开了,已经切开了,只是600bp比较弱的话,可以尝试加大酶切体系(如增大酶切体系为原来的两倍或三倍),酶切后乙醇沉淀富集酶切片断后用小体积TE溶解后电泳,效果可能有所改善。如果根本就没有切开的话,那就要考虑是否是酶的问题,buffer的问题或质粒的问题。将载体和目的片段(PCR扩增产物,约500bp,两端设有酶切位点)分别用EcoR1和BamH1双酶切后,定向连接。但载体上该双酶切位点间有一个800bp的片段,酶切后电泳可见这一片段,表明酶切成功,胶回收了大片段。连接转化成功后,挑选的单菌落提质粒,PCR鉴定表明有目的片段,约500bp,但双酶切却仍然是800bp的原片段长度。目的片段不含有双酶切位点。请问连接是否成功?若成功了,为何会出现这种奇怪的现象?参考见解:如果pCR没有污染1、
假设挑选的是单菌落,则有可能是因为自己引物非特异扩增。PCR比酶切更易出问题,相信酶切结果,没连上。2、
假如PCR没有问题,最可能是菌被污染,连上了,但有污染。这种可能性大。假阳性产生的可能性极大。3、
最好重新挑科隆,摇菌。如果不行再用通用引物确定是否没有连上。4、
应该使用载体引物来作PCR鉴定,因为自己的引物作很有可能出现假阳性。5、
片断是500bp的,而载体切下来的片断中含有800bp,是否是因为重组质粒的浓度太低,使得800bp的片断可以见到,而没有办法看见500bp的,所以建议将重组质粒酶切量增加,电泳时上样量增加。6、
可以看到800bp的片断,应该是载体自连接,因为插入片断后载体的酶切位点移位,应该没有办法再次切下800bp的片断,所以建议重新挑菌再作。7、
如果您能通过PCR检测出您提取的质粒中含有目的片断,而双酶切时却只能显示应该切除的片断,说明可能出现的情况是:您的连接成功,但是您挑取的菌落并不是单克隆,而是包含有假阳性的混合菌落,而且假阳性菌落比例高于需要的阳性菌落,导致在进行摇菌扩增质粒时,同时大量扩增了假阳性质粒,从而出现上面描述的情况.8、
如果打算从新开始酶切,连接,转化的话,建议加大酶切时酶的使用量,在酶切片断回收时尽量不要切下杂带,这样可以尽量减少自连假阳性的可能性。9、
如果不打算从新做过,建议在原来已经铺好细菌的LB固体培养基上,再挑取一些菌落,可以一次性多挑几个单克隆(记住,一定要是单克隆,否则很难处理),中心的和周边的,大的和小的,都挑一些,然后用国产质粒提取试剂盒进行小量提取,并且酶切鉴定,这样可以节省大量的时间,并且取的不错的效果,在用试剂盒提取之前每个菌落保留1~2ml菌液,冻存,并标记好对应的试管,如果之后发现那个菌落是阳性克隆的话,回过头来就可以使用冻存的菌液大量提取了。

2.纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式,我推荐柱式,因为割胶手法不准,很容易割下大块的胶,影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物,既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以,PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒

双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要,我一般酶切3个小时,其实1个小时已经足够。应用大体系,如100微升。纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式,我推荐柱式,因为割胶手法不准,很容易割下大块的胶,影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物,既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以,PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒

载体用CIAP,37度处理30分钟后,用连接酶自连,转化一个克隆没有,同时用处理过的载体与100bp的外源片段连接,转化后也一个克隆都不长.载体和目的片段的摩尔比在1:10。阳性对照长的也很好,该怎么办?参考见解:1、
片断回收后电泳验证;如果外源片断是切胶回收,一定要在长波下操作2、
载体与目的片段的摩尔比应该是1:1,质量比可以在1:3-10,多做几个梯度,不可能什么都不长的。3、
插入片断要求酶切好,很多时候是酶切不完全而根本不能连接。比例是载体:目的片段=1:2到1:3之间。很容易连上。需要做PCR-based
siRNA,其中的质粒模板不够,所以做转化扩增后再抽提质粒。做了3次转化都出不来,总结问题如下:1.质粒是以前抽提过的,浓度很大,但没有做过电泳,直接加1ul转的2.感受态制备好的,在冰上直接化开作的。3.直接用分子克隆上的方法,100ul感受态+1ul
质粒 冰上30min,42度热激 90se c, 冰上 2min,加 LB 复苏150rpm
45min,涂Amp板100ul,
16h,但是只有第3次长了1各菌落,怀疑没有转好长得杂菌。请问这里有什么问题,有哪些要改进的?参考见解:
感受态保存时间不要太长,最好3个月以内,保存负70度,时间长效率会降低的。如果合适,可以用蓝白筛选阳性菌落,X-GAL和IPTG是40:7,兰色为阴性,白色阳性保存正确的温度最少是-20℃,一般长期保存需要放置-70℃.就算是-70℃保存,一般经过3个月以上后,质粒会降解非常大.在做转化之前一定是先要鉴定质粒的浓度和质量的.如果有条件可以利用仪器测试浓度,简单的办法就是取一定量进行电泳,然后和marker比较,来测定浓度。
转化过程中的温度非常重要,特别是42℃这步,都精确到考虑Ep管管壁厚薄的影响.
关于只有第3次长了1各菌落,怀疑没有转好长得杂菌。”首先,16h是不够的,最少也要观察48h,因为转化了质粒的细菌不比正常细菌,受了伤长得很慢而且数量不会很多,有5~6个菌落就是非常好的现象.就算长了一个菌落可以挑出来摇摇看,也许就是需要的。底物DNA没有被所用限制酶切断,怎么办?参考见解:底物DNA没有被所用限制酶切断,可以考虑以下几种情况:1、
底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA,碱基易发生缺失、变化等。2、
限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感,从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响,3、
底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质,会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下,底物DNA须重新进行纯化。4、
限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置,对酶切反应也有一定的影响。5、
测定Sac?II酶是否失活,可用确定带该酶的一个底物,做个酶切验证就行。请问感受态细胞里自身没有质粒吗?感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的DNA有影响吗?参考见解:1、
感受态细胞自身有没有质粒同制备感受态之前的细胞有关,在制备感受态细胞的过程中,不会对细胞自身的质粒造成什么影响。2、
感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的DNA不会有影响,转座子也会插入到导入的质粒上,可能因为发生的频率比较低,所以不考虑。实验需用PZero
T载体,该载体需用高转化效率的感受态细胞进行转化反应,请问哪种感受态细胞是高转化效率的感受态细胞?参考见解:其实DH10B,DH5a,TOP10都可以,关键不是看用什么细胞,而是用什么方法制备感受态细胞,一般电转化都轻松可以达到5*10^9cfu/ug
DNA以上.CaCL2处理一般都是5*10^6cfu/ug DNA-5*10^7cfu/ug
。买回来的菌种均为感受态细胞,能否将它们象菌种一样制备感受态细胞,有没有影响?参考见解:1、
保存这样的菌种,不如将质粒转化进去后,再保留有重组质粒的细菌,加入等量的30%甘油后,可以长期保存。如果直接将感受态细菌接种,肯定丧失了摄取外源基因的能力,但可以用来重新制备感受态细胞。如果加入甘油后保存在-70度冰箱内,可以长期使用,但想当作菌种是不行的。其实制备感受态细胞的方法很简单,除了冰,只要氯化钙,大约一个多小时就可以搞定,所以需要时,可以随时制备,也可以制备一批,加入甘油后在-70度保存。2、
利用感受态细胞再来制作感受态,行肯定行,但转化效率不会很高,制备高效率的感受态细胞,其中关键的步骤是一定要细菌生长状态好。而人工制备的感受态细胞经过低温,高浓度离子,相当于细菌受过一次“伤”。因此用来做菌种保存不是太适合。“感受态”以及“感受态细胞”的概念?参考见解:“感受态”是细胞处于易于接纳外源性目的基因进入细胞的一种状态。“感受态细胞”是指处于感受态的细胞。一般情况下,外源性基因很难进入到细胞内只有当细胞处于感受态时,外源性基因才能较容易的进入细胞。制作感受态细胞的方法有很多。在加Cacl2
步骤换成了加Cacl2-Mgcl2为什么? 这样做效果好么?
怎么简便的观察感受态细胞的效果? 参考见解:Mg可以提高感受态效率。
其实可以试试TSS一步法:TSS液:10% PEG,5%DMSO,20-50mmol/lMg
2+的LB,PH:6.5
;摇菌DD600=0.3-0.4,(其实不必要侧,菌液有絮状浑浊就可以了) 离心集菌,
悬于少量TSS液中,加入质粒混匀,
置于4C冰箱中5-60min,加SOC或LB,培养1小时即可铺板。比CaCl法更简单,效果也还可以。
失败的原因只有一个:混进水去了。?混进水指的是收集细菌时残留的LB过多,要把管壁的残液尽量控净或擦净,
当然制备好的TSS中混进水去更不行。TSS液越老越好,TSS制备时LB多点少点问题不大,制备完后,静置时间越长,制备感受态效果越好,但制备后再混进水或LB,能使感受效率降低到刚制备的状态。转化时间不宜过长,TSS不光可以做感受态,还可抑制细菌生长。用于制备感受态细胞的氯化钙可以高压灭菌吗?参考见解:可以高压灭菌,高压时旋松些瓶盖,防止爆裂。当压好后,立即旋紧
4度保存,使用时按无菌原则。但最好不要高压灭菌
cacl2的浓度直接影响着感受态的转化效率cacl2浓度要控制在0.1mol/L
所以可以先过滤Imol/L母液用0.22um滤器过滤除菌 4度保存 使用时在超菌台
再用双蒸水稀释10倍使用。感受态细胞是否可以转变成为正常的菌种?参考见解:将感受态细胞用无抗生素的LB稀释10000-100000倍后,再涂布到无抗生素的LB琼脂平板上,可以保存或用于进一步制备感受态细胞。或者做转导之前的感受太细胞融化后析出1ul放到不含抗生素的LB肉汤里摇菌,然后再保存菌种。需要时再复苏,按照常规作感受态的方法作。感受态细胞可以作为菌株来源并再制作感受态细胞吗?

3.酶量的问题:以TAKARA的为例,其对1单位酶的定义如下:在50 μl
反应液中,30℃温度下反应1小时,将1 μg
的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位。
而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的
因素外,该酶可分解15μg的DNA,而一般从1-4ml菌液提出的
DNA约为3μg,而PCR纯化后的产物约为3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的
质量好,酶切完全切得动。

酶量的问题:以TAKARA的为例,其对1单位酶的定义如下:在50 μl
反应液中,30℃温度下反应1小时,将1 μg
的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位。
而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的
因素外,该酶可分解15μg的DNA,而一般从1-4ml菌液提出的
DNA约为3μg,而PCR纯化后的产物约为3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的
质量好,酶切完全切得动。

载体用CIAP,37度处理30分钟后,用连接酶自连,转化一个克隆没有,同时用处理过的载体与100bp的外源片段连接,转化后也一个克隆都不长.载体和目的片段的摩尔比在1:10。阳性对照长的也很好,该怎么办?参考见解:1、
片断回收后电泳验证;如果外源片断是切胶回收,一定要在长波下操作2、
载体与目的片段的摩尔比应该是1:1,质量比可以在1:3-10,多做几个梯度,不可能什么都不长的。3、
插入片断要求酶切好,很多时候是酶切不完全而根本不能连接。比例是载体:目的片段=1:2到1:3之间。很容易连上。需要做PCR-based
siRNA,其中的质粒模板不够,所以做转化扩增后再抽提质粒。做了3次转化都出不来,总结问题如下:1.质粒是以前抽提过的,浓度很大,但没有做过电泳,直接加1ul转的2.感受态制备好的,在冰上直接化开作的。3.直接用分子克隆上的方法,100ul感受态+1ul
质粒 冰上30min,42度热激 90se c, 冰上 2min,加 LB 复苏150rpm
45min,涂Amp板100ul,
16h,但是只有第3次长了1各菌落,怀疑没有转好长得杂菌。请问这里有什么问题,有哪些要改进的?参考见解:
感受态保存时间不要太长,最好3个月以内,保存负70度,时间长效率会降低的。如果合适,可以用蓝白筛选阳性菌落,X-GAL和IPTG是40:7,兰色为阴性,白色阳性保存正确的温度最少是-20℃,一般长期保存需要放置-70℃.就算是-70℃保存,一般经过3个月以上后,质粒会降解非常大.在做转化之前一定是先要鉴定质粒的浓度和质量的.如果有条件可以利用仪器测试浓度,简单的办法就是取一定量进行电泳,然后和marker比较,来测定浓度。
转化过程中的温度非常重要,特别是42℃这步,都精确到考虑Ep管管壁厚薄的影响.
关于只有第3次长了1各菌落,怀疑没有转好长得杂菌。”首先,16h是不够的,最少也要观察48h,因为转化了质粒的细菌不比正常细菌,受了伤长得很慢而且数量不会很多,有5~6个菌落就是非常好的现象.就算长了一个菌落可以挑出来摇摇看,也许就是需要的。底物DNA没有被所用限制酶切断,怎么办?参考见解:底物DNA没有被所用限制酶切断,可以考虑以下几种情况:1、
底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA,碱基易发生缺失、变化等。2、
限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感,从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响,3、
底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质,会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下,底物DNA须重新进行纯化。4、
限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置,对酶切反应也有一定的影响。5、
测定Sac?II酶是否失活,可用确定带该酶的一个底物,做个酶切验证就行。请问感受态细胞里自身没有质粒吗?感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的DNA有影响吗?参考见解:1、
感受态细胞自身有没有质粒同制备感受态之前的细胞有关,在制备感受态细胞的过程中,不会对细胞自身的质粒造成什么影响。2、
感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的DNA不会有影响,转座子也会插入到导入的质粒上,可能因为发生的频率比较低,所以不考虑。实验需用PZero
T载体,该载体需用高转化效率的感受态细胞进行转化反应,请问哪种感受态细胞是高转化效率的感受态细胞?参考见解:其实DH10B,DH5a,TOP10都可以,关键不是看用什么细胞,而是用什么方法制备感受态细胞,一般电转化都轻松可以达到5*10^9cfu/ug
DNA以上.CaCL2处理一般都是5*10^6cfu/ug DNA-5*10^7cfu/ug
。买回来的菌种均为感受态细胞,能否将它们象菌种一样制备感受态细胞,有没有影响?参考见解:1、
保存这样的菌种,不如将质粒转化进去后,再保留有重组质粒的细菌,加入等量的30%甘油后,可以长期保存。如果直接将感受态细菌接种,肯定丧失了摄取外源基因的能力,但可以用来重新制备感受态细胞。如果加入甘油后保存在-70度冰箱内,可以长期使用,但想当作菌种是不行的。其实制备感受态细胞的方法很简单,除了冰,只要氯化钙,大约一个多小时就可以搞定,所以需要时,可以随时制备,也可以制备一批,加入甘油后在-70度保存。2、
利用感受态细胞再来制作感受态,行肯定行,但转化效率不会很高,制备高效率的感受态细胞,其中关键的步骤是一定要细菌生长状态好。而人工制备的感受态细胞经过低温,高浓度离子,相当于细菌受过一次“伤”。因此用来做菌种保存不是太适合。“感受态”以及“感受态细胞”的概念?参考见解:“感受态”是细胞处于易于接纳外源性目的基因进入细胞的一种状态。“感受态细胞”是指处于感受态的细胞。一般情况下,外源性基因很难进入到细胞内只有当细胞处于感受态时,外源性基因才能较容易的进入细胞。制作感受态细胞的方法有很多。在加Cacl2
步骤换成了加Cacl2-Mgcl2为什么? 这样做效果好么?
怎么简便的观察感受态细胞的效果? 参考见解:Mg可以提高感受态效率。
其实可以试试TSS一步法:TSS液:10% PEG,5%DMSO,20-50mmol/lMg
2+的LB,PH:6.5
;摇菌DD600=0.3-0.4,(其实不必要侧,菌液有絮状浑浊就可以了) 离心集菌,
悬于少量TSS液中,加入质粒混匀,
置于4C冰箱中5-60min,加SOC或LB,培养1小时即可铺板。比CaCl法更简单,效果也还可以。
失败的原因只有一个:混进水去了。?混进水指的是收集细菌时残留的LB过多,要把管壁的残液尽量控净或擦净,
当然制备好的TSS中混进水去更不行。TSS液越老越好,TSS制备时LB多点少点问题不大,制备完后,静置时间越长,制备感受态效果越好,但制备后再混进水或LB,能使感受效率降低到刚制备的状态。转化时间不宜过长,TSS不光可以做感受态,还可抑制细菌生长。用于制备感受态细胞的氯化钙可以高压灭菌吗?参考见解:可以高压灭菌,高压时旋松些瓶盖,防止爆裂。当压好后,立即旋紧
4度保存,使用时按无菌原则。但最好不要高压灭菌
cacl2的浓度直接影响着感受态的转化效率cacl2浓度要控制在0.1mol/L
所以可以先过滤Imol/L母液用0.22um滤器过滤除菌 4度保存 使用时在超菌台
再用双蒸水稀释10倍使用。感受态细胞是否可以转变成为正常的菌种?参考见解:将感受态细胞用无抗生素的LB稀释10000-100000倍后,再涂布到无抗生素的LB琼脂平板上,可以保存或用于进一步制备感受态细胞。或者做转导之前的感受太细胞融化后析出1ul放到不含抗生素的LB肉汤里摇菌,然后再保存菌种。需要时再复苏,按照常规作感受态的方法作。

4.酶切、回收后的PCR产物与载体的连接:摩尔比的计算,很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则
非常有必要。回收的载体片段:回收的PCR产物片段=1:10
,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA:(X
pmoles×长度bp×650)/ 1,000,000
(注:长度bp×650是该双链DNA的分子量)所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol
1000bp
DNA=0.66μg,如载体是5380bp,则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算,很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则
非常有必要。回收的载体片段:回收的PCR产物片段=1:10
,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA:(X
pmoles×长度bp×650)/ 1,000,000
(注:长度bp×650是该双链DNA的分子量)所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol
1000bp
DNA=0.66μg,如载体是5380bp,则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。测DNA浓度可以在专用机子上测,注意OD值,一般约1.8-2.0.另外,如果嫌麻烦,也可用MARKER进行估测,如MARKER2000,5微升的
MARKER每个条带约50ng。

5.测DNA浓度可以在专用机子上测,注意OD值,一般约1.8-2.0.另外,如果嫌麻烦,也可用MARKER进行估测,如MARKER2000,5微升的
MARKER每个条带约50ng。

连接反应:TAKARA的 连接酶上的
说明写的过夜,而其对连接酶单位的定义为:在20 μl的连接反应体系中,6
μg的λDNA-Hind
III的分解物在16℃下反应30分钟时,有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位。而它的浓度为350
U/μl
,所以完全够用。连接酶容易失活,注意低温操作,最好在冰上。时间3个小时足已。

6.连接反应:TAKARA的 连接酶上的
说明写的过夜,而其对连接酶单位的定义为:在20 μl的连接反应体系中,6
μg的λDNA-Hind
III的分解物在16℃下反应30分钟时,有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位。而它的浓度为350
U/μl
,所以完全够用。连接酶容易失活,注意低温操作,最好在冰上。时间3个小时足已。

3、转化:a、全量加入至100 μl JM109感受态细胞中,冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl
AMP阴性培养基,37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。也可离心后余100μl几个非常重要的问题1
做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.2
对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里,烤箱一般温度为55-60度,然后做的时候拿出来,这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立:为验证双酶切是否成功,可做如下对照:A
酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时,也要进行对照.
设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都’正常’的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。经PCR鉴定,克隆90%-100%的阳性率,所以在后面的
挑克隆中,我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定,测序。。。。。。

7.转化:a、全量加入至100 μl JM109感受态细胞中,冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl
AMP阴性培养基,37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。也可离心后余100μl几个非常重要的问题:1
做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.2
对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里,烤箱一般温度为55-60度,然后做的时候拿出来,这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立:

生技网(www.biogo.net)

为验证双酶切是否成功,可做如下对照:

A
酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时,也要进行对照.
设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都’正常’的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。经PCR鉴定,克隆90%-100%的阳性率,所以在后面的
挑克隆中,我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定,测序。。。。。。

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